O estudo, publicado online na Cell em 4 de agosto, consegue realizar múltiplos tipos de manipulações precisas de DNA variando de escalas de quilobase a megabase em organismos superiores, especialmente em plantas.

A pesquisa extensiva demonstrou o enorme potencial do sistema de recombinação site-específica Cre-Lox para manipulação cromossômica precisa. No entanto, sua aplicação mais ampla tem sido dificultada por três limitações críticas:

1. As reações de recombinação reversíveis — que decorrem da simetria inerente dos locais Lox — podem anular edições desejadas.
2. A natureza tetramérica da recombinase Cre complica os esforços de engenharia, dificultando a otimização da atividade.
3. Os locais Lox remanescentes após a recombinação podem comprometer a precisão da edição.

A equipe de pesquisa abordou cada um desses desafios e desenvolveu métodos inovadores para avançar o estado dessa tecnologia. Primeiro, eles criaram uma plataforma de alto rendimento para a modificação rápida de locais de recombinação e propuseram um design de local Lox assimétrico. Isso resultou no desenvolvimento de novas variantes de Lox que reduziram a atividade de recombinação reversível em mais de 10 vezes (aproximando-se do nível de controle negativo) enquanto mantinham uma alta eficiência de recombinação direta.

Em seguida, eles aproveitaram seu modelo AiCE (Restrições Informadas por IA para Engenharia de Proteínas) — um sistema de evolução dirigido por proteínas que integra modelos gerais de dobramento inverso com restrições estruturais e evolutivas — para desenvolver o AiCErec, um método de engenharia de recombinases. Essa abordagem permitiu a otimização precisa da interface de multimerização da Cre, resultando em uma variante engenheirada com uma eficiência de recombinação 3,5 vezes maior que a da Cre selvagem.

Por fim, eles projetaram e aperfeiçoaram uma estratégia de edição sem cicatriz para recombinases. Ao aproveitar a alta eficiência de edição dos prime editors, desenvolveram o Re-pegRNA, um método que utiliza pegRNAs especificamente projetados para realizar re-prime editing nos locais Lox remanescentes, substituindo-os precisamente pela sequência gênica original, garantindo assim modificações genômicas sem interrupções.

A integração dessas três inovações levou à criação de duas plataformas programáveis, PCE e RePCE. Essas plataformas permitem o programação flexível das posições e orientações de inserção para diferentes locais Lox, possibilitando a manipulação precisa e sem cicatrizes de fragmentos de DNA que variam de quilobase a megabase em células tanto de plantas quanto de animais. As conquistas-chave incluem: a integração direcionada de grandes fragmentos de DNA de até 18,8 kb, a substituição completa de sequências de DNA de 5 kb, inversões cromossômicas abrangendo 12 Mb, deleções cromossômicas de 4 Mb e translocações de cromossomos inteiros.

Como prova de conceito, os pesquisadores utilizaram essa tecnologia para criar germoplasma de arroz resistente a herbicidas com uma inversão precisa de 315 kb, demonstrando seu potencial transformador para engenharia genética e melhoria de culturas.

Este trabalho pioneiro não apenas supera as limitações históricas do sistema Cre-Lox, mas também abre novas possibilidades para engenharia genômica precisa em uma variedade de organismos.